Die Herausforderungen bei der Synthese von Iro meistern

Wissenschaftler entwickeln ein effizientes Eintopfprotokoll für die zellfreie Synthese komplexer Eisen-Schwefel-Proteine

Tokioter Institut für Technologie

Bild: Dieses Diagramm zeigt die beiden Hauptschritte des vorgeschlagenen Syntheseprotokolls. Schritt 1 zeigt die chemische Kaskade zur Schaffung einer sauerstofffreien Umgebung sowie das PURE-System zur Synthese der „unreifen“ (Apo-)Proteine. Schritt 2 zeigt die Implementierung der SUF-Maschinerie, die den [4Fe–4S]-Cluster zu den Apo-Proteinen hinzufügt, wodurch funktionelle und reife [4Fe–4S]-Proteine ​​entstehen.mehr sehen

Bildnachweis: Wiedergabe von Wang und Nishikawa et al. 2023 ACS Synthetische Biologie

Fe-S-Cluster, die Teil von Fe-S-Proteinen sind, kommen in allen Lebensformen vor. Sie spielen eine wichtige Rolle als biologische Cofaktoren – Helfermoleküle, die diese Proteine ​​bei verschiedenen biochemischen Transformationen unterstützen – und sind an der Atmung und dem Stoffwechsel beteiligt. Diese Cluster sind von großem Forschungsinteresse, da sie als entscheidender Teil der Evolution gelten. Sie dienen als Bindeglied zwischen der präbiotischen Chemie (chemische Prozesse, die vor der Entstehung von Lebensformen existierten) und den komplexen molekularen und biologischen Systemen, die wir heute kennen. Vereinfacht gesagt könnten sie einer der primitiven Katalysatoren sein, die zur Entstehung des Lebens auf der Erde geführt haben. Daher werden praktische Methoden zur Synthese von Fe-S-Proteinen hoffentlich unser Verständnis der jungen Erdbiologie verbessern und uns helfen, die ultimative Frage nach dem Ursprung des Lebens zu beantworten.

Trotz ihrer Verbreitung hat sich die Synthese reifer Fe-S-Proteine ​​außerhalb der Zelle als Herausforderung erwiesen. Sie erfordern nicht nur eine komplizierte zelluläre Maschinerie für die Synthese, sondern werden auch bei Kontakt mit Sauerstoff aufgrund der Reaktion mit ihren Fe-S-Clustern leicht abgebaut. Daher waren Wissenschaftler gezwungen, den komplizierten Weg zu beschreiten, bei dem zunächst ein unvollständiges (oder „Apo“)-Protein hergestellt und extrahiert wurde, gefolgt von seiner Reifung (Zugabe des Fe-S-Cofaktors) unter streng sauerstoffarmen Bedingungen. Was diesen Prozess jedoch noch schwieriger macht, ist das Vorhandensein kontaminierender eisenhaltiger Proteine ​​im Endextrakt.

In einer aktuellen Studie entwickelte ein Forscherteam, darunter die außerordentlichen Professoren Kosuke Fujishima und Shawn McGlynn vom Earth-Life Science Institute (ELSI) des Tokyo Institute of Technology und Assistenzprofessor Po-Hsiang Wang von der National Central University, ein neuartiges Protokoll für Herstellung reifer [4Fe-4S]-Proteine, in denen der Fe-S-Cluster in einer würfelförmigen Struktur angeordnet ist. Das Team entwickelte einen speziellen Weg des Fe-S-Assemblierungsproteinsystems, der in einer sauerstofffreien Umgebung funktionieren würde, da ein Sauerstofffängersystem vorhanden ist, um reife Fe-S-Proteine ​​zu liefern.

Die Forscher versuchten zunächst, das sogenannte Schwefelbildungssystem (SUF) aufzubauen. In Bakterien enthält dieses Multiproteinsystem alle notwendigen Maschinen zur Bildung von [4Fe-4S]-Clustern. Im Vergleich zu anderen Signalwegen mit ähnlichen Funktionen (z. B. der Stickstofffixierung und dem Eisen-Schwefel-Clustersystem) weist es eine höhere Sauerstofftoleranz auf. Das Forschungsteam entwickelte einen rekombinanten SUF-Weg, der aus sechs Proteinuntereinheiten besteht und in einer zellfreien Umgebung funktionieren kann.

Um eine sauerstofffreie Umgebung im Reagenzglas aufrechtzuerhalten, führten die Forscher anschließend eine Drei-Enzym-Kaskade (eine Reihe von drei enzymatischen Reaktionen, die nacheinander ablaufen) ein, die als Sauerstofffängersystem dient. Dieses Spülsystem entfernt zwar Sauerstoff aus der Umgebung, verbessert aber auch die Effizienz des Systems. Dies wird durch die Produktion von reduziertem Flavinadenindinukleotid (FADH2) erreicht, einem Elektronenträger, der für die Synthese des Fe-S-Clusters durch das SUF-System benötigt wird.

Für die Synthese des Apo-Proteins schließlich wendete das Team eine spezielle zellfreie Methode an, die die In-vitro-Produktion von Proteinen mithilfe der rekonstituierten zellfreien Proteinsynthese, bekannt als PURE-System, ermöglicht. Durch die Hinzufügung von genetischem Material (DNA oder mRNA) und den notwendigen Energiequellen fungiert das PURE-System im Wesentlichen als künstliche Proteinfabrik.

Daher kombinierten die Forscher das PURE-System, die O2-abfangende Enzymkaskade und die Komponenten des SUF-Signalwegs in einem einzigen Röhrchen, um eine zellfreie Eintopfsynthese von zwei repräsentativen [4Fe-4S]-Proteinen durchzuführen: Aconitase und Thermophilic Ferredoxin. Shota Nishikawa, ein Co-Erstautor und Doktorand, erklärt die iterativen Prozesse, die durchlaufen werden, um die Teile des Puzzles zusammenzufügen: „Es war eine Herausforderung, die richtige Stöchiometrie und Substrat-/Cofaktor-Konzentration zu finden. Dennoch haben wir gründlich vorgegangen.“ Studien zur Charakterisierung des richtigen Verhältnisses der im PURE-System benötigten Enzyme.“

Das in dieser Studie entwickelte Protokoll hat erhebliche Auswirkungen auf die wissenschaftliche Gemeinschaft. „Wir haben eine neuartige und praktische Methode für die Synthese reifer Fe-S-Proteine ​​entwickelt, die kein sperriges Handschuhfach mehr erfordert“, betont Fujishima. Er behauptet, dass ihr Protokoll die traditionellen Herausforderungen des [4Fe–4S]-Clusteraufbaus und der O2-Empfindlichkeit überwindet, die in den Bereichen der synthetischen Biologie und der anaeroben Enzymologie große Hindernisse darstellten. Durch eine deutliche Erweiterung der Fähigkeiten des PURE-Systems könnte die von den Forschern vorgeschlagene Strategie zur Entwicklung neuer Biotechnologien und zu einem besseren Verständnis der Grundlagen der Proteinsynthese und -assemblierung führen.

Mit Blick auf die Zukunft stellen die Forscher fest, dass diese Arbeit mehrere Türen für kommende Studien öffnet. Die Möglichkeit, sauerstofffreie In-vitro-Umgebungen zu implementieren, könnte Wissenschaftlern dabei helfen, andere Arten von Multiproteinwegen zu replizieren, wie etwa die Wege der Stickstofffixierung (NIF) und des Eisen-Schwefel-Clusters (ISC), um andere Metall-Cofaktor-tragende Enzyme zu synthetisieren. Dies wiederum könnte zur Entwicklung neuer Biokatalysatoren und synthetischer Zellen mit potenziellen Anwendungen in der Umweltsanierung, Energieerzeugung, Medizin und Astrobiologie führen.

Referenz

Po-Hsiang Wang1,2*, Shota Nishikawa3,4, Shawn Erin McGlynn3,5 und Kosuke Fujishima3,6*, Eintopf-De-Novo-Synthese von [4Fe-4S]-Proteinen unter Verwendung eines rekombinanten SUF-Systems unter aeroben Bedingungen, ACS Synthetic Biologie, DOI: 10.1021/acssynbio.3c00155

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ACS Synthetische Biologie

10.1021/acssynbio.3c00155

Experimentelle Studie

Unzutreffend

Eintopf-De-novo-Synthese von [4Fe-4S]-Proteinen unter Verwendung eines rekombinanten SUF-Systems unter aeroben Bedingungen

19. Juli 2023

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